EN

Bio-techne|化学发光法:不是所有的 ELISA 都要测 OD 值哟

大家好,我是小菜鸡张三,万万没想到师兄让我寄几独立做 ELISA 了。这个我懂,平时跟着师兄勤学苦练,拍板加样我是有模有样。

待我左手一个 OD450 nm,右手一个 540,纳尼?化学发光法 ELISA 说明书上怎么没有 OD 值的要求啊?「少年郎,不是所有的 ELISA 都要测 OD 值哟。」暗中观察已久的师兄得意扬扬地飘过。

下面是小博士上课时间

什么是化学发光法 ELISA?

酶联免疫吸附测定法(ELISA)。首先将酶直接标记在抗原或抗体上,再经过抗原与抗体结合形成抗原抗体免疫复合物。通过不同底物与酶反应后产生的特定产物的特性,达到定量检测特定分子的目的。根据底物及相应产物的不同,ELISA 可分为比色法(Colorimetric)与化学发光法(Chemiluminescent)两类。

化学发光法酶联免疫分析系统(Chemiluminescent ELISA)是在免疫反应结束后,加入酶的发光底物,产生处于激发态的中间体。之后中间体会发射光子释放能量以回到稳定的基态,此发光强度可由光度计(Luminometer)进行检测,并利用标准曲线计算出被测物的含量。相比于比色法,化学发光法具有更高的灵敏度和更宽的检测范围。

常见的化学发光组合是鲁米诺(3-aminophthal hydrazide, Luminol)底物与辣根过氧化物酶反应。鲁米诺于 1928 年首次被合成为化学发光底物,该底物的发光反应需要苛刻的条件,发光暗淡且持续时间短。

之后研究人员发现,加入增强剂的增强型鲁米诺反应(图 1)能够长时间产生明亮且稳定的发光效果,从而使得其广泛应用于免疫分析,目前 R&D Systems® 的 QuantiGlo® 系列及 Novus Biologicals® 的 Chemiluminescent ELISA 均采用此原理。

图 1:增强 luminol/peroxide 底物用于化学发光检测

QuantiGlo® ELISA Kit 的基本检测步骤

第一步:向包被有捕获抗体的微孔板中加入样品或标准品,孵育使分析物与包被的抗体结合,将未结合的其他分子清洗掉。

第二步:加入 HRP 偶联的抗体(检测抗体)并与一抗捕获的分析物结合。未结合的检测抗体被冲洗掉。

第三步:加入增强的鲁米诺底物,使之与 HRP 反应发光,发光强度与样品中存在的分析物数量成正比。利用微孔板光度计测量发光强度。

QuantiGlo® 试剂盒检测参数设置及应用举例

如 QuantiGlo® 试剂盒说明书所列,光度计设定可以使用以下参数或同等参数:1.0 分钟滞后时间、检测时间 0.5 秒/孔、求和模式、自动增益或同等。

需要注意的是:

相对光单位(Relative light units,RLUs)数值由不同光度计检测可能不同,需要按照仪器制造商的建议调整设置。

相对光单位的数值可能在 15 分钟的阅读窗口期间内发生变化,由于需要参考标准曲线数值换算,所以这并不会影响结果。

 

应用举例 1:Human VEGF QuantiGlo ELISA Kit(货号 QVE00B)

使用 MOLECULAR DEVICE 品牌的 SpectraMax® L 微孔板化学发光酶标仪进行检测(SpectraMax® M5/M5e 和 FlexStation® 3 多功能酶标仪的化学发光检测模式也适用)。数据的收集和计算推荐由 SoftMax® Pro 软件完成,其预设的模板极大地简化了相应流程。

实验步骤及仪器参数设置:

1. 每孔加入 150 μL 实验稀释液 RD1-8;

2。 在微孔板中按 3 复孔形式加入 50 μL 标准品或空白对照(Calibrator 稀释液)。室温轻度振荡(推荐  500 ± 50 rpm)微孔板 2 小时;

3. 孵育结束后使用排枪吸干孔内反应液,并用 400 μL 洗涤液清洗 4 遍。最后吸干剩余洗涤液并在干净的吸水纸上拍干;

4。 每孔加入 200 μL VEGF 复合物,贴上新的粘合带。室温轻度振荡 (推荐 500± 50 rpm) 微孔板 3 小时;

5。 按照步骤 3 进行清洗步骤;

6。 每孔加入 100 μL Glo 工作液,室温避光孵育 5 至 20 分钟;

7. 用 SpectraMax® L 微孔板化学发光酶标仪测定 RLU 值。相关参数如下:1 秒检测时间,PMT 自动和 470 nm 目标校准波长。

结果:显示由 SpectraMax® L 微孔板化学发光酶标仪按照上述的参数所得的 VEGF 标准曲线, 其动态范围超过 4 个数量级,计算所得的检测限,也就是空白对照信号标准差 3 倍值的相应量为 1.5 pg/mL,与该试剂盒平均检测下限为 3.3 pg/mL 相符。

图 2,20,000-1。3 pg/mL 的标准品检测曲线图。实验由 SpectraMax® L 微孔板化学发光酶标仪按照 1 秒检测时间,PMT 自动和 470 nm 目标校准波长的参数进行读取。标准曲线由 SoftMax® Pro 软件绘制。

应用举例 2:Human IL-6 QuantiGlo ELISA Kit(货号 Q6000) 

使用 DYNEX TECHNOLOGIES 品牌的 MLX™ 微量滴定光度计测量光的强度,绘制标准曲线,并分析结果。由于底物发光持续时间长,所以阅读窗口期可以是加入底物后的 20~40 分钟之间。实验步骤均严格按照试剂盒说明书操作。

仪器参数设定:

① 起始模式(Start Mode):1 分钟滞后时间

② 振荡及温度设定:关闭(Off)

③ 检测选项:

  • 自动读取 (Auto Gain)
  • 求和模式 (Sum all Readings)
  • 检测时间 1 秒/孔

 

软件操作:

① 只含有校准稀释液(Calibrator Diluent)的标准品零值孔被定义为空白孔(Blank):
含有其他不同浓度标准品的孔被定义为 S1-S5 孔。
含有阳性对照(Control)的孔根据对应标签使用「用户可定义的类型(User Definable Types)」定义为 LL、L、M、H。
含有样本的孔需定义为测试品(Tests)。

② 在空白模式窗口中,选择平均(Average)。将所有空白孔(标准品零值孔)取平均值,其他孔值将统一减去这个平均值。

③ 在曲线拟合(curve fit)窗口中,输入 S1-S5 的 IL-6 标准品浓度,并在相对光(Relative Light)窗口使用 log/log Cubic Spline 模式拟合并绘制曲线。

④ 数据矩阵(Data Matrix)及拟合曲线图将呈现在测试报告(Test Report)中。

结果:

——「喔,我明白了,师兄选这个盒子是考虑到实验组间样本中目标分析物的含量差异大,过多的稀释操作一方面费时费力,另一方面容易造成误差对吧,师兄果然厉害!」

——「其实,主要还是因为我懒……」

 

以上文字和图片来源于Bio-techne

 

 

 

附件:
 
九龙彩票注册开户投注平台 江苏快三质合走势图 四柱彩票注册 六合开奖网址 立鼎彩票注册开户投注平台 玖壹彩票注册开户投注平台 鸿途彩票注册开户投注平台 PK10哪个平台赔率高 彩70注册开户投注平台 江苏快三