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Bio-techne|选好对照,给实验上道保险

当我们历经种种挑战获得实验结果,经常会发出疑问三连:

  • 我的实验结果是不是准确?
  • 我的结果是否出现假阳性或假阴性?
  • 结果的差异是不是因实验设计中的变量造成的?

要回答这些问题,合适的对照样品就成了不可或缺的一环。

 

一、阴性对照与阳性对照

  • Western Blot 实验结果有杂带?
  • IHC 实验没有阳性信号?
  • 目的蛋白表达定位与文献报道的有出入怎么办?

要回答这些问题,就需要在实验中设置阴性或阳性对照。

阳性对照品一般会使用文献或数据库中报道的高表达目的蛋白的组织或细胞。阳性对照确保了实验的灵敏度,也保证了实验过程中抗原抗体的结合效率。

阴性对照品一般会使用或文献或数据库中报道的低表达目的蛋白的组织或细胞,使用敲低或敲除目的基因的样本。在 IHC/ICC 实验中,也可以用 PBS 或同型对照代替一抗。阴性对照确保了实验的特异性,排除非特异性信号对结果造成的干扰。

 

接下来,我们举个例子:

比如用二乙基亚硝胺诱导小鼠肝纤维化,常常用 Alpha-SMA 作为肝纤维化的标志物。在进行 IHC 实验时,为了保证阳性信号的可靠性,就需要平行加一个胃或结肠组织的样本作为对照。因为,Alpha-SMA 会特异性的表达在平滑肌细胞,而黏膜细胞无表达。

图片来源:W Li et al。 Cell Death Dis (2019)。

如上图的所示,胃平滑肌层阳性信号明显,黏膜层无阳性信号,证明抗体得到的信号是敏感且特异的(Alpha-SMA,货号 NBP2-33006)。

 

二、同型对照

这个概念,相信深谙流式细胞技术的小伙伴都耳熟能详。因为抗体本身的特殊功能,特别是抗体 IgG Fc 段与细胞的 Fc 受体结合的能力,会使实验结果的非特异性信号加强。

同时,在一些抗体的功能性实验,比如中和实验和封闭实验中,也会对细胞(尤其是免疫细胞)的生理功能产生一定的影响,进而导致实验结果与预期或文献报道不相符。

抗体结构与抗体类型示意图

这时,同型对照就是必不可少的工具:

同型对照是阴性对照的一种,是利用与实验抗体同亚型的免疫球蛋白,排除实验本底信号的工具。广泛运用在免疫组化、免疫荧光、流式细胞术、抗体封闭中和实验等一些以抗原-抗体结合为基础的实验中。

同型对照需要选用与目标抗体相同种属来源、相同的免疫球蛋白类型及亚型的抗体。如果是应用在流式细胞术,还需要标记相同的荧光素。我们通常建议选用来自与特异荧光抗体相同生产厂家的同型对照抗体, 因为其生产工艺、荧光蛋白比值以及标记工艺都是相同的。

比如:

用  Mouse Anti-Human MICA PE-conjugated Monoclonal Antibody(货号 FAB1300P)检测 K562  细胞表面的 MICA,因为该抗体的种属来源是小鼠,免疫球蛋白是 IgG,亚型是 2B,标记的荧光素是 PE,所以,我们使用的同型对照应该是 Mouse IgG2B PE 抗体(货号 IC0041P)。

如上图,左边蓝色的峰为同型对照,右边橙色的峰为 MICA 特异性的 PE 信号峰。有了同型对照,自然就能分辨出合适的阳性荧光强度,为之后设门和进一步分析打下可靠的基础。

设置合适的对照就像给实验加上一层保险,保证了实验结果的可靠性,也为后续实验的优化及 trouble shooting 提供了重要的线索。

 

以上文字和图片来源于Bio-techne

 

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