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MDCK.STAT1KO 细胞——流感疫苗的新选择

据报道,目前每年都会有20%的人感染流感病毒,接种流感疫苗是抵御病毒的有效防范措施。

传统的流感疫苗采用将流感病毒株接种到鸡胚,经培养、收获病毒液,病毒灭活、纯化等步骤制成。这种工艺路线成本相对较高,而且污染微生物的风险较高,对接种者有可能引起过敏反应。因而,利用哺乳动物细胞作为细胞基质生产疫苗是另外一种选择,有利于迅速实现规模化生产。

2012年,美国FDA批准Flucelvax作为第一个哺乳动物细胞(MDCK)生产的美国流感疫苗。

对于疫苗生产来说,如何优化工艺,最大程度的提高产能,降低生产成本,一直是永恒的话题。除了优化下游的步骤,是否有可能从上游细胞入手,通过改变关键基因获得产病毒能力更高的MDCK细胞株?

 

ATCC把目标锁定在了STAT1基因。

STAT1蛋白是细胞干扰素抗病毒应答的重要分子。ATCC通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术成功敲除MDCK STAT1基因,开发了一个新的细胞模型MDCK.STAT1KO (ATCC® CCL-34-VHG)。

实验证明基因编辑后的细胞没有STAT1蛋白表达,与亲本细胞系相比,病毒产生能力明显增加,接种甲型流感(H1N1;ATCC®VR-1736™)后,病毒滴度提高了30倍。

图1. 甲型流感(H1N1;ATCC®VR-1736™) 接种 STAT1-KO-MDCK 细胞实验结果。(A)MDCK WT 亲本和 MDCK.STAT1 型 KO 细胞,接种甲型流感,48小时后收集细胞上清液。绿色-抗流感病毒染色,蓝色-核染色。(B)感染甲型流感病毒48小时后细胞上清液的TCID50值。(C) RT-PCR法定量检测感染48小时后甲型流感病毒基因组拷贝数。

图2。 STAT1-KO-MDCK 细胞特征。(A)MDCK。STAT1KO 细胞 STAT1 基因测序结果证实STAT1基因断裂。(B)测序结果显示,MDCK。STAT1KO 细胞是一个杂合子。一条等位基因存在单一碱基插入,另一个等位基因存在4碱基的缺失。(C)WB结果显示,无论是低代次还是高代次, MDCK。STAT1KO 细胞都没有 STAT1  蛋白表达。

图3. STAT1-KO-MDCK 细胞无 Cas9/CMV 基因序列的整合。

图4。 STAT1-KO-MDCK 细胞,未发现脱靶效应导致的非靶向突变。

 

改良后的MDCK细胞(MDCK。STAT1KO (ATCC® CCL-34-VHG))大大提高了病毒生产滴度,稳定的STAT1敲除基因型,无Cas9/CMV 基因序列的整合,无脱靶导致的突变。以上特征使得该细胞成为基础研究、病毒疫苗生产的一个优质细胞模型。
 

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